Desmond Miles est un Américain de 25 ans, kidnappé par Abstergo, une firme pharmaceutique dont il ne sait rien. Fils de membres de la confrérie des Assassins, il est loin de se douter de la guerre qui oppose ses ancêtres aux Templiers. Il l'apprendra à ses dépens, alors qu'il coopère contre sa volonté avec Abstergo, pour retrouver la trace des mystérieux artefacts. En réalité, l'énigmatique firme pharmaceutique est une couverture qui sert les intérêts des Templiers à travers le monde et les siècles. Desmond est alors forcé d'aider ses ravisseurs et malgré lui, il revivra quelques passages clés de ses ancêtres (Altaïr dans Assassin's Creed 1, Ezio dans Assassin's Creed II), pour découvrir où se cachent les objets de pouvoir. Pour ce faire, Abstergo a travaillé pendant de nombreuses années sur le projet Animus. En partant du principe que les souvenirs d'une personne sont génétiquement codés dans sa séquence ADN, et sont donc transmis de génération en génération, l'Animus permet de revivre le passé de ses ancêtres. Enfin au point, la machine à explorer le passé est alors utilisée sur de nombreux patients. Dix-septième « sujet » utilisé, Desmond semble être enfin celui qui mènera les Templiers à leur but ultime.

Si la majorité du temps, on se retrouve aux commandes de l'un de ses ancêtres assassins, au travers de l'Animus, les jeux proposent aussi tous de jouer certaines séquences en 2012, en compagnie de Desmond. Ces passages nous permettent d'en apprendre plus sur la grande machination des Templiers. Dans le premier volet, Desmond est enfermé dans les locaux d'Abstergo où il se rend vite compte de la raison pour laquelle il est là. Dans la salle, le joueur rencontrera Warren Vidic, chef du projet, mais aussi Lucy Stillman, l'assistante dont le rôle prendra de l'ampleur dans les volets suivants. Desmond, même s'il n'aide les Templiers que parce qu'il y est contraint, essayera tout de même de contrer leurs plans servant au mieux les Assassins.