Desmond pilote donc de nouveau Ezio. Celui-ci s'étant enfin vengé des conjurés et ayant enfin mis la main sur l'artefact, goûte un repos mérité dans la villa familiale. Mais son répit est de courte durée, car la ville est prise d'assaut par une armée innombrable. Malgré ses efforts pour la défendre, Monteriggioni tombe aux mains de l'ennemi, qui n'est autre que César Borgia, rejeton direct de Rodrigo Borgia, chef des Templiers et ennemi d'Ezio. César s'empare de la Pomme et Ezio se voit contraint de revêtir une nouvelle fois sa tenue d'Assassin.

L'action se déroule cette fois à Rome, une ville totalement contrôlée par les Borgia. Ezio s'y rend avant tout pour récupérer l'artefact volé et pour empêcher les Borgia de s'en servir. Il retrouvera là bon nombre de ses anciens comparses, dont Machiavel, le chef des Assassins, ainsi que d'autres tels que La Volpe, le chef de la guilde des voleurs, ou Bartolomeo, le chef des mercenaires. Leonardo da Vinci apparaît aussi brièvement. Ce dernier est forcé de créer des machines de guerre pour César, engins qu'Ezio se fait un plaisir de détruire. Ezio reforme aussi l'ancien Ordre des Assassins en recrutant des opposants au pouvoir des Borgia et ensemble, ils espèrent mettre un terme aux agissements de la famille corrompue.