Brotherhood introduit encore de nouveaux éléments. Le plus important est sans aucun doute l'apparition de la confrérie des Assassins. Durant tout le jeu, Ezio peut recruter des citoyens mis à mal par les Borgia et en faire de véritables meurtriers. Chaque recrue peut effectuer des missions à travers toute l'Europe et gagne alors argent et expérience. Chaque niveau atteint par un Assassin lui confère une amélioration d'arme ou d'armure. Enfin, et surtout, Ezio peut faire appel à ses confrères à tout moment, pour se débarrasser facilement des gardes parfois trop nombreux. Il faut noter que chaque Assassin atteignant le statut de maître a droit à sa cérémonie d'intronisation, tout comme Ezio dans le second opus.

Dans Brotherhood, l'arsenal d'Ezio s'élargit encore et de plus en plus d'armes à distance font leur apparition. On peut se demander si ce n'est pas contradictoire par rapport aux fondements du jeu. Néanmoins, rien n'oblige de les employer et dans certaines situations délicates, il s'agit d'une aide non négligeable.

Le système d'amélioration des bâtiments est toujours présent mais revu. Maintenant, ce sont presque tous les commerces de la ville de Rome qui peuvent être restaurés et l'argent des revenus peut être perçu dans chaque banque. Finis les incessants allers-retours à Monteriggioni pour percevoir notre dû. En plus de cela, le fait d'améliorer un bâtiment permet tout simplement d'y faire des achats, ce qui rend la ville un peu plus animée à chaque rénovation. Mais pour pouvoir faire des travaux, il faut au préalable éliminer l'influence des Borgia dans la zone. Pour ce faire, certaines tours doivent être détruites, libérant ainsi la zone du joug qu'elle subissait. Néanmoins, la tâche n'est pas si facile qu'elle en a l'air. Chaque tour est sous la coupe d'un capitaine Borgia. Il faut donc au préalable le supprimer avant de mettre le feu à la tour. Evidemment, ces capitaines ont la fâcheuse tendance de fuir à votre approche. Il faut donc être une véritable ombre pour éviter de se faire repérer.

On peut aussi noter l'apparition d'un nouveau système très sympathique. Chaque mission (même les secondaires) comporte deux niveaux de synchronisation (50% ou 100%), en fonction que l'on réussisse ou non un objectif bonus. Il s'agit par exemple de ne pas toucher le sol une seule fois au cours de la mission, tuer une cible avec la lame secrète (alors qu'elle s'enfuit ou peut difficilement être atteinte au corps-à-corps), ne tuer personne, etc. Bien sûr, se synchroniser à 100% est nettement plus difficile mais rajoute pas mal de durée de vie. Pour autant, pas de panique, toutes les missions sont cette fois rejouables et il est donc possible de réaliser tous les objectifs bonus lors d'un second essai, même si on ne les a pas eus la première fois.